خرید و فروش ارز

بازدارنده های رشد: این مواد با محروم کردن میکروارگانیسم های بیماری زا از مواد غذایی مورد نیاز در متابولیسم شان عمل می کنند.
ترانسفرین : آهن یک عنصر اساسی در تثبیت عفونت توسط اکثر پاتوژن ها است. ترانسفرین ها گلیکوپروتئین هایی با میل ترکیبی شدید با آهن می باشند که دسترسی پاتوژن ها را به آهن محدود می کنند.
اینترفرون: توسط برخی از ماهیان استخوانی از جمله قزل آلای رنگین کمان بعد از عفونت ویروسی تولید شده و میزان تولید آن به درجه حرارت آب بستگی دارد.
مهار کننده های آنزیمی : پاتوژن ها آنزیم هایی تولید می کنند تا میزبان را تحت تاثیر قرار داده و غذای خود را فراهم سازند، در مقابل سرم مهره داران محتوی بازدارنده های آنزیمی مانند آنتی پروتئازها برای دفاع از خود هضمی است و همچنین نقش مهمی در خنثی سازی آنزیم های تولید شده توسط پاتوژن ها ایفا می کنند.
لیزین ها : آنزیم هایی هستند که به تنهایی یا در ترکیب با سایر مواد باعث لیز کردن سلول های پاتوژن می شوند.
کمپلمان : کمپلمان ها از مهمترین فاکتور های دفاعی هستند که از حدود 35 پروتئین محلول در پلاسما تشکیل شده اند، که 9 جزء اصلی آن با نام های C1 تا C9 نامگذاری شده اند. این ترکیبات نقش کلیدی در ایمنی ذاتی و اکتسابی ایفا می کنند(Boshra et al., 2006). سیستم کمپلمان به وسیله سه مسیر مختلف اما همگرا، فعال می شوند، که شامل مسیر وابسته به ایمنوگلوبین یا مسیر کلاسیک، مسیر مستقل از ایمنوگلوبین یا مسیر فرعی و مسیر لکتین است. روش کلاسیک که نیاز به ایمنوگلوبین دارد و زمانی که سلول های هدف با آنتی بادی پوشیده شوند، فعال شده و غشای سلول هدف را از بین می برد. روش آلترناتیو که توسط عوامل مخصوصی مثل سموم باکتریایی، پلی ساکارید، زیموژن و ... فعال می شوند. روش لکتین که جهت فعال شدن نیازمند اتصال ترکیبات لکتین با کربوهیدرات سطح میکروارگانیسم های بیماری زا می باشد. سیستم کمپلمان در ماهیان استخوانی مشابه اغلب مهره داران می باشد. بسیاری از محرک های ایمنی باعث افزایش فعالیت کمپلمان در سرم ماهیان می شوند Montero et al., 1999)).
لیزوزیم : لیزوزیم بر روی اجزای پپتیدوگلیکانی دیواره سلولی میکروارگانیسم ها اثر می گذارد. در حالی که برخی از باکتری ها مستقیما توسط لیزوزیم لیز می شوند، در اکثر موارد غشای خارجی دیواره سلولی باکتری باید توسط کمپلمان پاره شده تا لیزوزیم به راه ورود دسترسی یابد. در ماهیان لیزوزیم در سرم و موکوس جداسازی شده است.
پروتئین فاز حاد : در جریان عفونت حاد پستانداران تشکیل شده و نقش حفاظتی دارد . در تعداد کمی از ماهیان وجود آن گزارش شده است.
آنتی بادی های طبیعی : که از جنس ایمنوگلوبین نیستند (Whyte,2007; Roberts, 1989).
سیستم دفاعی سلولی غیر اختصاصی :
گرانولوسیت ها و مونوسیت ها نقش کلیدی را در بخش سلولی سیستم دفاعی ذاتی در ماهیان بازی می کنند. ماکروفاژها و گرانولوسیت ها اغلب در خون و بافت های لنفوئیدی در مواقع التهاب و هجوم عوامل پاتوژن وارد عمل می شوند. در ماهیان سه گروه مونوسیت ها، ماکروفاژها و نوتروفیل ها نقش مهمی را در فرآیند بیگانه خواری ایفا می نمایند.
1-3-2-ایمنی اختصاصی:
در کنار ایمنی ذاتی مکانیسم های دفاعی تکامل یافته تری نیز وجود دارد که در پی رویارویی با آنتی ژن فعال شده و سپس در هربار برخورد با همان میکروب بر قدرت دفاعی و شدت پاسخگویی آنها افزوده می شود و از آنجا که این نوع ایمنی به صورت پاسخی در برابر عفونت شکل می گیرد، به آن سیستم ایمنی تطبیقی نیز گفته می شود.
مرکزیت مکانیزم دفاعی اختصاصی، لنفوسیت ها هستند. لنفوسیت ها در گردش خون، ارگان های لنفی و دیگر بافت ها بویژه در طی واکنش های التهابی دیده می شوند. لنفوسیت با تولید آنتی بادی (ایمنوگلوبین) در فرآیند دفاعی نقش دارند.
ایمنوگلوبین ها:
نقش حفاظتی آنتی بادی ها شامل خنثی سازی ویروس، از بین بردن باکتری، فعال کردن سیستم کمپلمان و بهبود فرآیند فاگوسیتوز می شود. آنتی بادی ها یک دسته از پروتئین ها هستند که ایمنوگلوبین نامیده می شوند. در پستانداران پنج دسته از ایمنوگلوبین ها وجود دارد اما در ماهیان استخوانی تنها یک نوع ایمنوگلوبین M وجود دارد (Sakai, 1999).
1-3-3-مواد تحریک کننده سیستم ایمنی:
محرک های ایمنی، عصاره های زیستی و یا مواد سنتزی می باشند که با افزایش عملکرد سلول های فاگوسیتوزکننده، فعالیت گلبول های سفید و تولید آنتی بادی موجب تحریک سیستم ایمنی می شوند. چنین موادی علاوه بر اینکه مقاومت موجود را نسبت به بیماری های عفونی بیشتر می کنند، خطر شیوع بیماری را نیز کم می کنند (Sakai, 1999). تحقیقات در زمینه مواد محرک سیستم ایمنی رو به پیشرفت است و مواد زیادی در حال حاضر در صنعت آبزی پروری استفاده می شود.
1-4-استرس در آبزی پروری:
در بین مهره داران، ماهیان فراوانترین و متنوع ترین آن ها با 27365 گونه بوده که در مطالعات رفتاری از آن ها به عنوان مدل های مناسب استفاده می کنند. یکی از مسائل عمده در آبزی پروری استرس است. ماهیان مکرراً در معرض عوامل استرس زا هم در محیط طبیعی و هم در شرایط پرورشی قرار دارند. هر کدام از عوامل زیست محیطی می تواند به عنوان یک منبع بالقوه استرس مورد توجه قرار بگیرد (Martinez-Alvarez et al., 2002). پرورش ماهیان در سیستم های پرورشی متراکم و محیط های مصنوعی منجر به قرار گرفتن آن ها در معرض فاکتورهای استرس زای مختلفی گردیده است که در شرایط طبیعی مشابه این حالت برای آن ها ایجاد نمی گردد (Weil et al., 2001).
روش های معمول در آبزی پروری نظیر صید، دستکاری، تراکم، نگهداری، نقل و انتقال و بیهوشی منجر به ایجاد استرس در ماهیان می شوند. در سیستم های پرورشی با مدیریت مطلوب استرس حاد کشنده به ندرت اتفاق می افتد، در حالیکه استرس مزمن ممکن است مسبب بسیاری از مشکلات سیستم های نگهداری ماهی نظیر افزایش حساسیت به بیماری، افزایش سرعت متابولیک و مصرف انرژی، کاهش میزان رشد، اختلال در سیستم ایمنی و ممانعت از رسیدگی گناد و یا تخم ریزی باشد که این موارد تحت عنوان واکنش های ثانویه به استرس معرفی می شوند (Weil et al., 2001).
1-4-1-مراحل فیزیولوژیک بروز استرس:ماهیان حتی در بهترین شرایط زیست محیطی، تحت تأثیر خصوصیات فیزیکی، شیمیایی و فیزیولوژیک آب می باشند و وابستگی زیادی به عوامل مختلف محیطی و فیزیولوژیک دارند (بهمنی، 1378). استرس بخش گریز ناپذیر از زندگی ماهیان محسوب می شود و این امر خصوصاً در مورد ماهیانی که در سیستم های پرورشی متراکم ساکن هستند، بیشتر صادق است. پاسخ استرس در ماهی به سه دسته تقسیم بندی شده است:
پاسخ اولیه وصول یک حالت تغییر یافته و شروع پاسخ عصبی درون ریز را نشان می دهد که قسمتی از پاسخ استرس شایع در ماهی را تشکیل می دهد. این پاسخ شامل رهاسازی سریع هورمون های استرس، کتکول آمین ها و کورتیزول در سیستم گردش خون می باشد. آدرنالین از بافت کرومافین در بخش قدامی کلیه ماهیان استخوانی عالی و همچنین از انتهای عصب آدرنرژیک آزاد می شود. در پاسخ به هورمون های هیپوفیز، کورتیزول از بافت بین کلیوی که در رأس کلیه قرار دارد ترشح می شود (Balm et al., 1994).
پاسخ ثانویه استرس شامل تغییرات و تنظیمات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی مختلف مرتبط با استرس می باشند و تا حدودی توسط هورمون های استرس وساطت می شوند. آدرنالین و کورتیزول شماری از مسیرهای متابولیکی را فعال نموده که منجر به تغییراتی در فاکتورهای بیوشیمیایی خون ماهی می شود. استرس فرایندی انرژی خواه است و موجود برای جبران استرس از طریق فعالیت های متابولیکی ، سوبسترای انرژی را متابولیز می کند (Vijayan et al., 1997).
پاسخ نوع سوم نمایانگر تغییرات در کل موجود یا در سطح جمعیت می باشد. اگر ماهی قادر به سازگاری با استرس نباشد، تغییرات در کل موجود به تقسیم مجدد انرژی به وسیله برگرداندن سوبستراهای انرژی برای جبران افزایش تقاضای انرژی و از طریق فعالیت های آنابولیکی مثل رشد و تولید مثل ممکن است رخ دهد.
بنابراین تماس طولانی مدت با یک عامل استرس زا، بسته به شدت و دوره می تواند باعث کاهش رشد، کاهش مقاومت به بیماری و کاهش موفقیت در تولید مثل و شنا گردد (Barton, 1997).
1-5-نوکلئوتید:
نوکلئوتید ها شامل ترکیبات بیوشیمیایی هستند که در بسیاری از فرآیند های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی نقش دارند. این فرآیند ها شامل ذخیره، انتقال و بیان اطلاعات ژنتیکی، نقش میانجیگری در متابولیسم انرژی، به عنوان ترکیبات کوآنزیم و محرک های آلوستریک می باشد (Cosgrove, 1998).
هرچند مبحث استفاده از نوکلئوتید به عنوان مکمل های غذایی چندین سال است که مطرح شده است اما استفاده از آن در صنعت آبزی پروری مربوط به سال های اخیر می باشد (Li and Gatlin, 2006). در گذشته به علت عدم مشاهده نشانه هایی از نقص در عملکرد فرآیندهای بیوشیمیایی در انسان یا سایر مدل های حیوانی در کمبود نوکلئوتیدها، آنها به عنوان ترکیبات غیرضروری محسوب می شدند اما تحقیقات اخیر نشان دهنده این است که فقدان نوکلئوتید در جیره باعث تخریب کبد، قلب، روده و کاهش کارایی سیستم ایمنی می شود (Grimble and Westwood, 2000) . تاثیر مکمل نکلئوتید در جیره بر رسیدگی لنفوسیت ها، تکثیر ماکرفاژها و افزایش بیگانه خواری، افزایش پاسخ های ایمنوگلوبینی و بیان ژنتیکی سلول های ایمنی (به طور مشخص سیتوکین ها) در انسان و سایر مدل های حیوانی در تحقیقات مختلف مشخص شده است (Gil, 2002). مکمل نوکلئوتید جیره در انسان باعث افزایش ترشح و ذخیره شیر در مادران می شود که این عمل توسط موسسه غذا و دارو آمریکا مورد تایید قرار گرفته است ( Aggett et al., 2003). تحقیقات اولیه در بررسی نقش نوکلئوتید در جیره ماهیان به اوایل دهه 1970 بر می گردد که اکثر تحقیقات در آن زمان روی اثرات این مواد به عنوان جاذب های شیمیایی بوده است (Li and Gatlin, 2006). با تحقیقات Burrells و همکارانش در سال 2001 و مشخص شدن اثرات مفید استفاده از نوکلئوتید بر روی سیستم ایمنی در ماهیان، مکمل نوکلئوتید مورد توجه جهانی قرار گرفت.
1-5-1-ساختار بیوشیمیایی نکلئوتید ها:
ساختار بیوشیمایی نوکلئوتید ها شامل یک بنیان نیتروژنی (پورین یا پریمیدین)، یک قند ریبوز(مونومر RNA ) یا 2- دی اکسی ریبوز(مونومرDNA ) و یک یا چند گروه فسفات است. باز های نیتروژنی پورین غالباً شامل: آدنین، گوانین، هیپوگزانتین و گزانتین بوده و باز های نیتروژنی پیریمیدینِ غالباً شامل اوراسیل، تیمین، و سیتوزین می باشد (شکل 1-1). مونوفسفات در پورین و پریمیدین توسط آنزیم های کیناز به دی فسفات و تری فسفات تبدیل می شود.
653222-99585شکل 1-1: ساختار بیوشیمیایی نوکلئوتیدها
نوکلئوتیدها بصورت پی در پی شکل گرفته واز بین می روند و معمولاً ازطریق 2 مسیر مهم de novo و salvage تشکیل می شوند. نوکلئوتیدها از طریقde novo از پیش ماده های آمینو اسید گلوتامین، آسپارتیک اسید، گلایسین، فورمات و دی اکسید کربن شکل می گیرد (Coscrove,1998 ). تقریبا همه اتم های هر دو بنیان به طور مستقیم یا غیر مستقیم مشتقات اسید های آمینه می باشند (Rudolph, 1994)(شکل 2-1).
1487805111125
شکل 2-1 : بیوسنتز انواع اتم ها در بنیان پورین و پیریمیدین
فسفوریبوز پیروفسفات (PRPP) یک منبع قندی پنتوز در بیوسنتز پورین و پیریمیدین می باشد. این ترکیب از ریبوز5-فسفات شکل می گیرد.گروه های پورین در سیتوزول سلول های پستانداران بوسیله گلایسین، آسپارتات، گلوتامین، مشتقات تترا هیدروفولات و CO2 سنتز می شوند، در حالی که پریمیدین ها بوسیله آسپارتات، گلوتامین و CO2 در سیتوزول و میتوکندری سلول های پستانداران سنتز می شوند. احتمالا این مسیر ها در ماهیان نیز مورد استفاده قرار می گیرد.
مسیر بیوسنتز پورین شامل 10 مرحله است. در مرحله اول PRPP در کنار کاتالیزور PRPP آمینوترانسفراز با گلوتامین ترکیب می شود و 5-فسفوریبوزیل آمین بوجود می آید. بعد از ده مرحله اولین ترکیب با بیان پورین یعنی اینوزین منوفسفات حاصل می شود که با توجه به نیاز های سلولی بهAMP و GMP تبدیل می شود. در بیوسنتز پریمیدین آسپارتات با کربامیل فسفات ترکیب شده و کربامیل آسپارتات بوجود می آید که بعدا اسید اوراتیک شکل می گیرد که به اورتیدین مونوفسفات (OMP) اولین شکل پریمیدین تبدیل می شود. یوریدین مونوفسفات(UMP) از OMP بدست می آید و سپسCTP TTP از UMP بدست می آید.
-133985139065
شکل 1-3 : بیوسنتزde nevo وsalvege پورین و پریمیدین ها (بر گرفته از Coscrove,1998)
نوکلئوتید ها همچنین از طریق salvage pathway توسط پیوند ریبوز فسفات با بازهای آزاد بوجود آمده از تجزیه هیدرولیتیکی اسیدهای نوکلئیک و نوکلئوتید موجود در غذا سنتز می شوند (Coscrove,1998)، توانایی این مسیر زمانی افزایش می یابد که نوکلئوتیدها از طریق غذا تامین شوند (Boza, 1998). میزان بیوسنتز در مسیر های de novo و salvage در اندام های مختلف متغییر است و به طور چشمگیری تحت تاثیر نیازهای متابولیکی یا فرآیندهای فیزیولوژیکی می باشد. سلول های قرمز خون، لنفوسیت ها، قلب و مغز می توانند سنتز نوکلئوتید را از طریق مسیر salvage انجام دهند. کبد مهمترین ارگان ذخیره کننده نوکلئوتید و اندام مهم انتقال آن در مواقع نیازهای فیزیولوژیکی می باشد. تحقیقات نشان داده است که مکمل نوکلئوتید در جیره باعث کاهش متابولیسم آن در کبد می شود (Lopez-Navarro et al., 1995) .در پستانداران محصول نهایی کاتابولیسم نوکلئوتید های پورین، اسید اوریک است در حالیکه در موجودات دیگر می تواند به شکل های قابل حل تبدیل شود. تولید نهایی کاتابولیسم نوکلئوتید های پیریمیدین شامل β- آلانین (از یوراسیل و سیتیدین) و β- آمینوایزوبوتیرات (از تیمیدین) که هر دو شکل قابل حل و به آسانی دفع می شوند (Rudolph, 1994).
1-5-2-منابع نوکلئوتید :
نوکلئوتیدها به صورت طبیعی در همه منابع غذایی با منشاء گیاهی و جانوری وجود دارد. اساساً میزان غلظت RNA وDNA در منابع غذایی به چگالی سلولی آنها بستگی دارد ( Gil, 2002) . ترکیبات نوکلئوتید در منابع غذایی مثل روغن ماهی، پروتئین حیوانی، پودر ماهی و بقولات (مخصوصا آدنین در نخود فرنگی چشم سیاه )، عصاره مخمر و موجودات تک سلولی از قبیل مخمر و باکتری ها که غنی ازRNA و DNA می باشند وجود دارد. جانوران آبزی منابع مهم طبیعی از ترکیبات پورین و پریمیدین می باشد (Devresse, 2000). مقدار و قابلیت دسترسی از نوکلئوتید در اقلام مختلف غذایی متفاوت است.
939469336605جدول 1-1: میزان نوکلئوتید در برخی از اقلام غذایی
در بین منابع پروتئین دریایی،آنچوی و ساردین میزان بالاتری از گوانین را نسبیت به ماکرل، اسکوئید و صدف کلام دارا می باشند. قابلیت دسترسی و جذب پذیری نیز بسیار مهم است. عصاره مخمر، پودر ماهی و پروتئین های حیوانی حاوی نوکلئوتید، قابلیت هضم پذیری و دسترسی بهتری برای ماهیان دارند (Li and Gatlin, 2006)
1-5-3-هضم و جذب نوکلوتیدها:
تحقیقات در انسان و سایر حیوانات نشان داد که توانایی گونه های مختلف در هضم وجذب نوکلئوتیدهای با منشاء خارجی متفاوت است. انسانها مجموعه ای از ترکیبات واسط نوکلئوتید را جذب می کنند اما موشها اساساً نوکلئوتیدها را به فرم نوکلئوزید جذب می کنند (Sonoda and Tatibana, 1998). تحقیقات بر روی هضم و جذب نوکلئوتیدها در ماهیان بسیار محدود است. در روده ماهیان حضور و نحوه عملکرد پروتئاز و آلکالین فسفاتاز که در هضم و جذب نوکلئوتید ها نقش دارند به اثبات رسیده است. نوکلئاز به عنوان مهم ترین آنزیم برای هضم نوکلئوتید در ماهی بخوبی مطالعه نشده است، اگرچه وجود آن در برخی از گونه های ماهیان از جمله قزل آلای رنگین کمان گزارش شده است (Li and Gatlin, 2006). قزل آلای رنگین کمان توانایی استفاده و استخراج اسید های نوکلئوتید منابع غذایی را برای رشد، پایداری سطح نیتروژن و احتمالا سنتز اسید های آمینه ضروری را دارا می باشد (Rumsey et al., 1992). تنها قسمت کوچکی از نوکلئوتید کل غذا به صورت نوکلئوتید آزاد هضم می شود، آلکالین فسفاتاز روده گروه فسفات را از نوکلئوتید جدا کرده وآن را به شکل نوکلئوزید در می آورد ودر نهایت نوکلئوزیدازها و نوکلئوتیدازها و نوکلئازهای مربوط به پانکراس برای تولید بازهای پورین و پیریمیدین های آزاد فعال می شوند (Li and Gatlin, 2006). بیشترین ظرفیت جذب اسید های نوکلئیک و محصولات مرتبط به آن مربوط به بخش قدامی روده می باشد (Boza, 1998). در قزل آلای رنگین کمان ترشح نوکلئازها و پروئتازها می تواند به وسیله آلوده کننده های محیطی مثل لیگنوسولفاتها متوقف شود این موضوع ممکن است نشان دهنده تاثیر فاکتورهای محیطی و فیزیولوژیکی بر روی هضم و جذب نوکلئوتیدها باشد (Li and Gatlin, 2006) . اطلاعات در مورد چگونگی تأثیر فاکتورهای محیطی، استرس و آلودگیها بر روی هضم نوکلئوتیدها ناشناخته است.
14878053175شکل1-3 : هضم و جذب اسید های نوکلئیک و محصولات مربوط به آن (برگرفته از Boza, 1998).
1-5-4-اثرات بیو لوژیک نوکلئوتید های جیره:
1-5-4-1- رشد و جاذب شیمیایی
موجودات آبزی به منظور شناسایی و حرکت به سوی شکار، تغذیه، فرار از شکارچی و یافتن جفت، از نشانه های شیمیایی انتقالی در آب بهره می جویند. علی رغم پیچیدگی های موجود درمحیط های آبی، این علایم شیمیایی اختصاصی قابل شناسایی هستند. با توجه به اینکه هزینه غذا در تمامی عملیات پرورش آبزیان یکی از هزینه های عمده محسوب می شود، به حداکثر رساندن غذای مصرفی و کاهش غذای هدر رفته دارای اهمیت فوق العاده ای درموفقیت صنعت آبزی پروری است. اولین مطالعات بر روی نوکلئوتید در تغذیه ماهیان مربوط به توانایی افزایش دلپذیری غذا بوسیله این ترکیبات می باشد. برای اولین بار Mackie (1973) اجزای با وزن مولکولی پایین اسکوئید را آنالیز کرد و نوکلئوتیدِ آدنوزین منوفسفات و نوکلئوزیدِ اینوزین را به عنوان جاذب های شیمیایی اصلی برای موجودات آبزی مثل لابستر تشخیص داد. در تحقیقی Kiyohara و همکاران (1975) وجود گیرنده های شیمیایی را روی لب های ماهی بادکنکی (Fugu rubripes) که به نوکلئوتیدها (AMP، IMP، UMP و ADP) از طریق روش های الکتروفیزیولوژیکی واکنش می دادند گزارش شده است. این آزمایشات اولیه منجر به کشف مهم اثر جاذب شیمیایی نوکلئوتیدهای جیره بر ماهی شد. در ادامه تحقیقات در بین 47 نوکلئوزید و نوکلئوتید بر اساس رفتار تغذیه ای ماهیان تغذیه شده، اینوزین و IMP قوی ترین محرک تغذیه ای چشایی برای توربوت (Scophthalmus maximus) می باشند (Li and Gatlin, 2006). مکمل جیره حاوی نوکلئوتید RNA استخراج شده از مخمر به طور چشمگیری پذیرش غذا را در ماهی قزل آلای رنگین کمان افزایش می دهد (Rumsey et al., 1992).همچنین نتایج مشابهی در مورد افزایش پذیرش غذا بوسیلهIMP در جک ماکرل (Trachurus murphyi) و باس دهان بزرگ (Micropterus salmoide) بدست آمده است (Li and Gatlin, 2006).
وقتی میزان کافی از نوکلئوتید خارجی در غذای مورد استفاده برای ماهیان وجود داشته باشد، ماهی شرایط رشد سریع و بدون استرس خواهد داشت (Low et al., 2003). وجود یک منبع خارجی از نوکلئوتیدها باعث افزایش رشد در ماهی و سخت پوستان در مراحل اولیه زندگی که بیشترین میزان تکثیر سلولی را دارند خواهد شد (Borda et al., 2003). اینوزین به طور چشمگیری باعث افزایش رشد در لارو توربوت می شود، در کنار اینوزین، اثرات افزایش رشد انواع نوکلئوتید ها در لارو تیلاپیا(Oreochromis niloticus) (Ramadan and Atef, 1991 ) و قزل آلای رنگین کمان (Adamek et al., 1996) مشاهده شده است. میزان افزایش رشد در استفاده از مکمل هایی غذایی معمولا در مراحل لاروی و قبل از بلوغ رخ می دهد (Li et al., 2004).
1-5-4-2- تولید مثل
در تولید مثل و مراحل تکامل لاروی تقسیم سلولی بسیار سریع است و این مراحل نیازمند مقادیر بالایی ازRNA وDNA می باشند. به نظر می رسد که افزودن نوکلئوتید در جیره ماهیان مولد باعث افزایش قابلیت دسترسی این ترکیبات و بهبود شرایط لارو می شود (Devresse, 2000).
یکی از کاربردهای مکمل نوکلئوتید در تغذیه حیوانات مربوط به استفاده آن در بالا بردن سلامت نوزادان می باشد، هر چند مطالعات در این زمینه در ماهیان بسیار محدود است. Gonzalez-Vecino و همکاران (2004) اولین مطالعه در مورد اثرات نوکلئوتید جیره را در ماهی چرب (Melanogrammus aeglefinus) انجام دادند و مشاهده کردند که بازماندگی لاروهای به وجود آمده از مولدینی که با جیره های دارای نوکلئوتید تغذیه شده بودند، نسبت به لاروهایی به وجود آمده از مولدینی که از جیره های عاری از نوکلئوتید تغذیه کرده بودند، بیشتر بوده است. به علاوه تکامل روده و اندازه لاروهای به وجود آمده از مولدین تغذیه شده با جیره های نوکلئوتید، نسبت به لاروهایی که از مولدین تغذیه شده با جیره های بدون نوکلئوتید حاصل شده بودند، به طور قابل ملاحظه ای بیشتر بوده است. نتایج مشابه ای در موردخیار دریایی مشاهده شده است (Li and Gatlin, 2006).
در ماهی هالیبوت آتلانتیک (Hippoglossus hippoglossus) که با جیره حاوی مکمل نوکلئوتید تغذیه شده اند میزان تولید تخم 30 درصد افزایش یافته است. همچنین میزان هماوری نسبی، حجم تخمها، درصد تفریخ و بازماندگی در لاروهای دارای کیسه زرده به طور قابل ملاحظه ای نسبت به گروه کنترل بیشتر بوده است. در مطالعات بعدی بر روی ماهی هالیبوت مشخص شده است که بازماندگی در لاروهای تغذیه کننده 25 درصد بیشتر از گروه کنترل بوده است. علاوه بر آن میزان توسعه مجاری گوارشی درلارو ماهیان تغذیه شده با مکمل نوکلئوتید نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است ( Devresse, 2000).
1-5-4-3-دستگاه گوارش
نوکلئوتید های جیره اثرات متعددی بر روی مجاری دستگاه گوارش حیوانات دارند، این تأثیرات شامل اثرات فیزیولوژیکی، مرفولوژیکی و میکروبیولوژیکی می باشد. نوکلئوتید جیره باعث افزایش رشد و تکامل و توسعه مجاری گوارشی می شود (Uauy et al., 1990). این ترکیبات همچنین باعث بهبود و اصلاح آسیب های روده می شوند و عملکرد باکتری های مفید روده را افزایش می دهد (Carver and Walker, 1995). تغذیه با نوکلئوتید باعث افزایش ارتفاع پرزها، افزایش میزان DNA و پروتئین های لایه مخاطی روده (Uauy et al., 1990)، افزایش ضخامت دیواره، تعداد سلول های پرزهای روده و فعال شدن آنزیم های هضم کننده (Bueno et al., 1994) در انسان و سایر مدل های جانوری می شود. نوکلئوتید جیره باعث بهبود اسهال مزمن در موش صحرایی و کاهش عوارض جانبی در نوزاد انسان می شود (Devresse, 2000). بهر حال تحقیقات در مورد پاسخ های گوارشی در ماهیان نسبت به تغذیه با مکمل نوکلئوتید در جیره به جز چند مطالعه مرفولوژیکی روده بسیار محدود است. Burrells و همکاران (b2001) برای اولین بار واکنش های مرفولوژیکی روده ماهی آزاد اقیانوس اطلس (Salmo salar) را به نوکلئوتیدهای جیره از طریق بررسی بافت شناسی کلاسیک مشخص کردند. در آن مطالعه، ارتفاع میانگین چین خوردگی روده در قسمت های قدامی، میانی و خلفی و همچنین مساحت کل سطح روده ماهیان تغذیه شده با جیره دارای نوکلئوتید به طور معنی داری بیشتر از گروه شاهد بود. همچنین نتایج مشابهی در سیم دریایی (Sparus aurata) جوان گزارش شده است (Borda et al ., 2003). روده یک اندام ایمنی بسیار مهم است و به نظر می رسد مکمل نوکلئوتید جیره در عملکرد بهداشتی روده در ماهیان تاثیر مثبتی دارد. علاوه بر این اثرات مفید، نوکلئوتید جیره سبب توسعه غشاء مخاطی بافت لنفوئیدی (MALT) و میکروفلور روده نظیر بفیدوباکترها در انسان و حیوانات مختلف می شود (Carver and Walker, 1995)، هرچند که مطالعات در مورد MALT در ماهیان بسیار محدود است. به علت تاثیرات مفید نوکلئوتید جیره بر روی اکولوژی میکروبی روده در ماهیان، این ترکیبات توانایی استفاده در صنعت آبزی پروری را همانند پریبیوتیک ها دارا می باشند (Li and Gatlin, 2006).
1-5-4-4-کبد و پارامتر های خون
کبد مهمترین ارگان ذخیره نوکلئوتید است. نوکلئوتید جیره بطور قابل ملاحظه ای غلظتRNA را در کبد افزایش می دهد (Lopez-Navarro et al., 1995). در کبد نوکلئوتید های خارجی سبب افزایش رشد سلولهای کبدی می شوند و نقش مهمی در سنتز گلیکوژن، پروتئین و کاهش تجمع چربی در کبد موش ها ایفا می کنند (Carver, 1994). یکی از شاخصهای مهم و قابل اطمینان در بررسی وضعیت سلامتی و فیزیولوژی ماهیان سنجش پارامترهای خون آنان می باشد که تحت تاثیر تغذیه، عوامل محیطی و سن آنان می باشد (Fanouraki et al., 2007 ). بنابراین برای مقایسه تاثیر رژیم های متفاوت غذایی بر سلامت بدن و سیستم دفاعی می توان شاخصهای خونی را مورد بررسی قرار داد (Rehulka et al., 2005). شاخصهای خونی را می توان به دو دسته تقسیم کرد:
شاخصهای هماتولوژی
شاخصهای بیوشیمیایی
از مهمترین شاخصهای هماتولوژی که مورد سنجش واقع می شوند می توان به شاخص های تعداد گلبولهای قرمز(RBC)، تعداد گلبول های سفید (WBC)، هموگلوبین(HB)، هماتوکریت (HCT)، درصد افتراقی گلبول های سفید و از مهمترین شاخصهای بیوشیمیایی که مورد سنجش واقع می شوند می توان به شاخص های پروتئین کل پلاسما (PTT)، آلبومین، کلسترول ، تری گلیسرید (TG)، آلکالین فسفاتاز (ALP)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST یا GOT) و گلوکز اشاره کرد.
در خصوص تاثیر نوکلئوتید جیره بر وظایف کبد ماهیان و پارامتر های خونی مطالعه ای انجام نشده است اما تحقیقات روی سایر موجودات از جمله موشها، حاکی از اثرات مثبت نوکلئوتید جیره بر بهبود وظایف کبد است. Lopez-Navarro و همکاران (1996) نشان دادند که حذف نوکلئوتید جیره سبب کاهش سنتز پروتئین در کبد و روده کوچک می شود. Ogoshi و همکاران (1985) گزارش کردند که مخلوط نوکلئوتید / نوکلئوزید سبب بهبود عملکرد کبد و ترمیم توازن نیتروژن بعد از 70 درصد ضایعات کبدی در موشها می شود. Perez و همکاران (2004) در مطالعات خود کاهش آسیب های کبدی در موش های تغذیه شده با مکمل نوکلئوتید جیره نسبت به گروه شاهد را گزارش کردند.
1-5-4-6-سیستم ایمنی:
مکمل نوکلئوتید جیره در پستانداران جوان باعث افزایش پاسخ های ایمنی و مقاومت در برابر بیماری ها می شود. تاثیر نوکلئوتید جیره در افزایش پاسخ های ایمنی در ماهیان در گونه های مختلف گزارش شده است. نوکلئوتید جیره باعث افزایش سلول های بیگانه خوار، گلبول های سفید، سلول های طبیعی کشنده، ایمنوگلوبین و بیان ژن های ایمنی در ماهیان افزایش می شود (Li and Gatlin, 2006).
ایمنی ذاتی:
تاثیر نوکلئوتید جیره در افزایش فعالیت و تعداد سلول های بیگانه خوار به خوبی مشخص شده است (Gil, 2002). همچنین این ترکیبات در ماهی باعث افزایش ترکیبات هورمونی و سلول های سیستم ایمنی ذاتی می شوند. نوکلئوتید خارجی در جیره می تواند فعالیت کمپلمان سرم (مسیر آلترناتیو) و فعالیت لیزوزیم، تکثیر ماکروفاژها و تولید آنیون سوپر اکسید از سلول بیگانه خوار قسمت قدامی کلیه در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) را افزایش دهد (Sakai et al., 2001). Li و همکاران (2004) گزارش کردند که هیبریدِ باس راه راه (Morone chrysops × Morone saxatilis) تغذیه شده با یک جیره حاوی نوکلئوتید، تولید رادیکال اکسایشی نوتروفیل بیشتری نسبت به جیره پایه داشت. در حالیکه بهبودی در انفجار تنفسی سلول های رأس کلیه مشاهده نشد. مکمل نوکلئوتید استخراج شده از مخمر باعث افزایش سلول های خونی دانه دار و بازماندگی بعد از رویارویی با عامل باکتریایی Vibrio harveyi در میگوی مونودون (Penaeus monodon ) می شود ( Devresse, 2000). نوکلئوتید جیره باعث ایجاد تغییرات در بیان ژن های ایمنی در برخی اندام ها در ماهی می شود. Low و همکاران (2003) تغییرات بیان ژن های ایمنی تحت تاثیر تغذیه با نوکلئوتید جیره را در ماهی توربوت (Scophthalmus maximus) بررسی کردند و شرح دادند که در کلیه و طحال میزان ترکیبات غیراختصاصی ایمنی مثل لیزوزم و همچنین بیان Intrerleukin-1β در کلیه به مقدار زیادی افزایش می یابد.
ایمنی اکتسابی اختصاصی:
نوکلئوتید جیره باعث افزایش فعالیت لنفوسیت ها و تولید ایمنوگلوبین می شود ( Navarro et al., 1996). نوکلئوتید جیره با تحریک سیستم ایمنی در ماهی باعث افزایش ایمنوگلوبین می شود. Ramadan و همکاران (1994) با انجام آزمایش بر روی ماهی تیلاپیا و بررسی سلول های ایمنی بعد از تزریق باکتری Aeromonas hydrophila گزارش دادند که میزان تیترآنتی بادی بعد از واکسیناسیون و همچنین واکنش های میتوژنی لنفوسیت ها در ماهیان تغذیه شده با نوکلئوتید افزایش می یابد. نتایج مشابهی در آزمایشات روی دیگر گونه ها مثل قزل آلای رنگین کمان (Burrells et al., 2001b) و هیبرید باس راه راه (Li et al., 2005) بدست آمده است. جیره حاوی نوکلئوتید باعث افزایش تحریک لنفوسیت در قزل آلایِ رنگین کمان (Leonardi et al., 2003)، بیان ترکیبات ایمنی اختصاصی مثل ایمونوگلوبولین (IgM) و ژن فعال کننده recombinase (RAG-1) در طحال و کلیه ماهی توربوت (Low et al., 2003) و افزایش کارایی واکسیناسیون در آزاد ماهی آتلانتیک (Burrells et al., 2001a) شده است.
1-5-4-7-پاسخ به استرس:
در صنعت آبزی پروری گونه های پرورشی در معرض بسیاری از استرس های فیزیولوژیکی قرار دارند که باعث سرکوب سیستم ایمنی، کاهش میزان رشد و افزایش احتمال وقوع بیماری می شود. در شرایط وقوع استرس، مکمل نوکلئوتید در جیره به پایداری شرایط فیزیولوژیکی ماهی کمک می کند (Devresse, 2000 ). در شرایط استرس زای مرتبط با آبزی پروری مثل کیفیت بد آب، تراکم و دستکاری، میزان تقاضای نوکلئوتید در سلول ها افزایش می یابد (Leonardi et al ., 2003). نوکلئوتید در جیره باعث افزایش ظرفیت تنظیم اسمزی و رشد در آزاد ماهی اقیانوس اطلس پس از استرس انتقال به آب شور شده است (Burrells et al., 2001a). بطور کل مهمترین ویژگی پاسخ به استرس در ماهیان، فعال شدن محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- بافت بین کلیوی (HPI) است که منجر به افزایش ترشح کورتیزول می گردد. این امر پاسخ سازشی سراسری است که طی آن کورتیزول ذخایر انرژی را به حرکت در می آورد تا به حفظ تعادل یونی کمک کند. اگر مقادیر کورتیزول در پلاسما به صورت مزمن بالا رود به جای نقش سازشی اثرات مخربی روی ماهیان ایجاد خواهد کرد (Barton, 2002). نوکلئوتید جیره باعث کاهش اثرات تخریبی استرس شوری در میگوی مونودون (Peneaus monodon) شده و کاهش اثرات تخریبی استرس و افزایش بازماندگی را در پی داشته است (Devresse, 2000).
1-5-4-8-مقاومت در برابر بیماری ها:
بازماندگی پس از رویارویی با پاتوژن های اصلی معمولا به عنوان "مقاومت در بیماری" شناخته شده است. نوکلئوتید جیره می تواند مقاومت ماهیان در برابر پاتوژن های مختلف از قبیل ویروس، باکتری ها و انگل را افزایش دهد. افزایش مقاومت در برابر عوامل بیماری زای باکتریایی در بسیاری از گونه ها از جمله در آزاد ماهیان (Burrells et al., 2001b)، کپور معمولی(Sakai et al ., 2001) و هیبرید باس راه راه (Li et al ., 2004) گزارش شده است.
وجود مکمل نوکلئوتید در جیره باعث کاهش میزان تلفات درآزاد ماهی اقیانوس اطلس بعد از تزریق میکروب کم خونی آزاد ماهیان (ISA) می شود (Burrells et al., 2001b). نوکلئوتید جیره در قزل آلای رنگین کمان باعث افزایش میزان بازماندگی بعد از تزریق ویروس عفونت لوزالمعده (IPN)Leonardi et al., 2003) ) و Vibro anguillarum (Burrells et al., 2001b) شده است. در کنار پاتوژنهای ویروسی و باکتریایی، جیره حاوی نوکلئوتید به طور چشمگیری میزان عفونت انگلی با شپش دریایی را در ماهی آزاد اقیانوس اطلس کاهش می دهد (Burrells et al., 2001a).
بعلت افزایش نگرانی ها در مورد وابستگی صنعت آبزی پروری به داروهای شیمیایی مخصوصاً آنتی بیوتیک ها، تحقیقات در مورد مواد مغذی افزایش دهنده ایمنی در موجودات آبزی اهمیت بالایی پیدا کرده است (Gatlin, 2002). تحقیقات نشان داده است که کاربرد نوکلوتید ها در بخش مدیریت بهداشتی آبزیان و کاهش خطر بیماری های عفونی در صنعت آبزی پروری بسیار سودمند می باشد.

1-6-پیشینه تحقیق:
Ramadan در سال 1991، تاثیر جیره حاوی نوکلئوتید آسکوژن به میزان 2/0 درصد بر هیبرید تیلاپیای 23 روزه را بررسی کردند که حاکی از افزایش رشد و بازماندگی بالاتر ماهیان موردمطالعه بوده است. آنهادر سال 1994 تاثیر مکمل جیره حاوی نوکلئوتید را در تیلاپیای 30 روزه مورد بررسی قرار دادند و مشاهده نمودند که واکنش های ایمنی هورمونی و سلولی تیلاپیا بعد از رویارویی با باکتریAeromonas hydrophila افزایش یافت. همچنین تیتر آنتی بادی و واکنش های میتوژنی لنفوسیت ها در ماهی تغذیه شده با جیره حاوی نوکلئوتید به طور معنی داری بیشتر از ماهیان گروه کنترل بوده است.
Adamek و همکاران در سال 1996، تاثیر مکمل جیره حاوی نوکلوتید آسکوژن را بر ماهی قزل آلای رنگین کمان4/163 تا 7/169 گرمی مورد بررسی قرار دادند و مشخص کردند که این مکمل باعث افزایش عملکرد واکسیناسیون ، رشد و تولید لنفوسیت ها می شود.
Burrells و همکاران در سال (a2001)، تاثیر جیره حاوی نوکلئوتید را به میزان 2/0 درصد در ماهی آزاد اقیانوس اطلس 03/43 گرمی آزمایش کردند و گزارش دادند که کلراید پلاسما در این ماهیان کاهش و میزان رشد افزایش پیدا کرده است.آنها در سال (b2001) در تحقیقی مشابه، جیره حاوی مکمل نوکلوتید را به میزان 2/0 درصد در ماهی آزاد کوهو و قزل آلای رنگین کمان مورد بررسی قرار دادند و متوجه شدند که ماهیان مورد آزمایش میزان بازماندگی بالاتری در مقابله با V. anguillarum ،Piscirickettsia salmonis و شپش های دریایی داشته اند.
Sakai و همکاران 2001. تاثیر جیره حاوی نوکلئوتید در ماهی کپور معمولی 100 گرمی را آزمایش کردند. آنها مشاهده نمودند که میزان فرآیند فاگوسیتوز ، قابلیت بهبود زخم و مقاومت در برابر باکتری Aeromonas hydrophila در ماهیان تغذیه شده با نوکلئوتید افزایش یافته است.
Leonardi در سال 2003 گزارش داد که مکمل نوکلوتید در ماهیان تمام ماده قزل آلای رنگین کمان باعث افزایش لنفوسیت B، مقاومت در برابر ویروسIPN و کاهش میزان کورتیزول پلاسما شده است.
Low و همکاران در سال 2003، تاثیر جیره غذایی حاوی مکمل نوکلوتید را بر بیان تعدادی از ژن های ایمنی در سپر ماهی 120 گرمی در 15 هفته را مطالعه نمودند، آنها اظهار داشتند که بیان Intrerleukin-1β افزایش معنا داری در کلیه ماهی تغذیه شده با نوکلئوتید نشان داد، در حالی که در بیان ترانسفرین با اضافه نمودن نوکلئوتید هیچ تغییری مشاهده نشد. بیان لیزوزیم به طور معنا داری در طحال و کلیه توربوت تغذیه شده با جیره دارای نوکلئوتید کاهش یافت، اما تأثیری روی آبشش ظاهر نشد.
Li و همکاران (2004) بیان داشتند که هیبریدِ باس راه راه 1/9-1/7 گرمی تغذیه شده با یک جیره حاوی نوکلئوتید آسکوژن تولید رادیکال اکسایشی نوتروفیل بیشتری نسبت به جیره پایه دارد. در حالیکه بهبودی در انفجار تنفسی سلول های رأس کلیه مشاهده نشد. همچنین مشاهده کردند که میزان بازماندگی ماهیان تغذیه شده با نوکلئوتید درمقابل عفونت باکتریایی Streptococcus iniaie به طور چشمگیری افزایش یافت. آنها با بررسی اثر نوکلئوتید جیره بر ترکیبات بدن (پروتئین، چربی، رطوبت و خاکستر) در ماهی هیبرید باس راه راه گزارش کردند که میزان چربی کل بدن در ماهیان تغذیه شده با نوکلئوتید نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
Li و همکاران (2005) ماهی های شوریده قرمز (Sciaenops ocellatus) (با وزن متوسط 2/10 گرم) را با سطوح مختلف نوکلئوتید جیره (1/0، 2/0و 3/0 درصد) به مدت 4 هفته مورد تغذیه قرار دادند. آنها اختلاف معناداری را در میزان رشد همه ماهی های تغذیه شده در سطوح مختلف نوکلئوتید جیره نسبت به گروه شاهد، در هفته اول مشاهده کردند. اما میزان رشد همه ماهی های تغذیه شده با نوکلئوتید جیره در 3 هفته بعد، نسبت به گروه شاهد تغییری نکردند همچنین آنها اظهار داشتند که میزان چربی کل بدن در تغذیه با نوکلئوتید افزایش یافت.
Lin و همکاران در سال 2009 گزارش کردند که جیره حاوی نوکلئوتید باعث افزایش عملکرد سیستم ایمنی و رشد ماهی هامور(Epinephelus malabaricus) می شود،آنهابیان کرند که میزان بازماندگی، ایمنوگلوبین و تولید آنیون سوپر اکسید O2 در سلول های قسمت قدامی کلیه در ماهیان تغذیه شده با جیره حاوی نوکلئوتید، نسبت به گروه شاهد افزایش چشمگیری یافته است.
سوداگر و همکاران در سال 1383، تاثیر نوکلئوتید جیره را بر شاخص های رشد و بازماندگی لارو فیل ماهی بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که افزودن نوکلئوتید در جیره غذایی لارو فیل ماهی سبب افزایش وزن، ضریب رشد ویژه، شاخص وضعیت، میزان بازماندگی و کاهش ضریب تبدیل غذایی و شاخص کیفیت شده است.
اوجی فرد و همکاران در سال1386، تاثیر نوکلئوتیدجیره بر برخی شاخص های فیزیولوژیکی میگوی وانامی را مود مطالعه قراردادند و به این نتیجه رسیدندکه نوکلئوتید جیره دارای اثرات مثبتی بر رشد و عملکرد فیزیولوژیکی میگوی وانامی است. دراین گونه میزان چربی و اسیدهای چرب DHA و EPA بافت میگوها که برای تغذیه انسان ها ضروری است، افزایش معناداری را نشان داد اما بقیه اسیدهای چرب و سایر ترکیبات بدن همچون پروتئین، خاکستر و رطوبت تفاوت معناداری را نشان نداد.
محمودی و همکاران 1386، در بررسی خود در ارتباط با تاثیر نوکلئوتید جیره بر شاخص های رشد ماهی آزاد دریای خزر (Salmo trutta caspius) نشان داد که افزودن نوکلئوتید جیره به ترکیب غذایی ماهی آزاد دریای خزر سبب بهبود شاخص های رشد شامل افزایش وزن بدن، درصد افزایش وزن بدن، ضریب رشد ویژه، نرخ بازده پروتئین، ارزش تولیدی پروتئین، میزان غذای مصرفی و کاهش ضریب تبدیل غذایی می شود. او همچنین میزان لیزوزیم سرم بچه ماهیان آزاد دریای خزر را نسبت به اثر نوکلئوتید جیره در هشت هفته بررسی کرد و مشاهده کرد که میزان فعالیت لیزوزیم سرم در ماهیان تغذیه شده با نوکلئوتید بطور معناداری بیشتر از گروه کنترل است.

فصل دوم:
مواد و روش کار
2-1-زمان و مکان انجام مطالعه :
این آزمایش در مهر ماه 1387 در کارگاه تکثیر و پرورش ماهیان سردآبی قزل برم واقع در استان چهارمحال و بختیاری در شهرستان لردگان در 160 کیلومتری مرکز استان انجام گرفت.آب این مرکز از چشمه برم تامین می گردد که دبی ورودی آن 1000 لیتر بر ثانیه می باشد.
اندازه گیری عوامل کیفی آب همچون دمای آب، اکسیژن محلول و pH به صورت هفتگی انجام گرفت. در طول دوره پرورش میانگین دمای آب 32/13 درجه سانتی گراد ، pH آب برابر 71/7 و اکسیژن محلول 27/8 میلی گرم بر لیتر محاسبه گردید.
2-2-طراحی و آماده سازی مکان تحقیق:
برای آماده سازی استخر ها جهت انجام تیمار های مختلف ابتدا با استفاده از میلگرد 16 و برش و جوش دادن آنها چارچوب را آماده و با بستن تور های پلی اتیلن قفس های موردنظر آماده گردید(شکل 2-1).
12807953175
شکل 2-1 : استخر های مورد استفاده جهت انجام آزمایش
2-3-تامین و معرفی بچه ماهیان به استخر ها:
بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان از قسمت تکثیر ماهیان با میانگین وزنی 01/ 0± 35/11گرم پس از طی عملیات رقم بندی تهیه شدند. قبل از ذخیره سازی، استخر ها بوسیله مواد ضد عفونی نظیر هیپو کلریت سدیم کاملاً ضدعفونی، سپس با آب شستشو داده شدند. ماهیان نیز ابتدا با محلول نمک 4 درصد ضدعفونی و سپس در داخل استخر های با ابعاد 2×8/0×1 متر (آبگیری 700 لیتر) به تعداد 60 عدد در هر استخر قرار گرفتند.
2-4-ساخت غذا و تغذیه ماهیان :
ماهیان بعد از 24 ساعت گرسنگی به دلیل حمل و نقل، به مدت یک ماه با جیره کنترل به منظور سازگاری تغذیه شدند. بعد از مرحله سازگاری در ابتدای آزمایش زیست سنجی ماهیان انجام شد. سپس با توجه به تیمارهای تعیین شده مکمل نوکلئوتید Optimun( حاوی AMP، IMP، UMP، GMP و CMP با نسبت مساوی، ساخت شرکت Chemoforma، سوئیس) در 4 سطح 5/0، 1، 5/1 و 2 گرم در کیلو گرم به جیره کنترل اضافه شد. تیمار پنجم گروه شاهد بود که هیچگونه مکملی به آن اضافه نشد. آزمایش در 3 تکرار در نظر گرفته شد. جیره ماهیان بر اساس پودر ماهی به عنوان منبع اصلی پروتئین، شامل 44 درصد پروتئین و انرژی ناخالص 2025کیلوژول بر کیلوگرم (NRC, 1993) با استفاده از نرم افزار لیندو (1/6 Releases، 1995Lindo copyright) فرمول بندی شد. از سلولز، پودر ماهی و آرد گندم و سویا برای تهیه جیره هایی با نیتروژن و لیپید یکسان در بین تیمارها استفاده شد (جدول2-1 و 2-2). مکمل معدنی و ویتامینی، ضد قارچ، دی کلسیم فسفات و ویتامین C ابتدا با هم مخلوط و به جیره پایه اضافه شدند. همچنین مکمل اپتیمون بر اساس دستورالعمل شرکت کموفورما ابتدا با آب مخلوط و سپس به جیره پایه اضافه شد. با مخلوط کردن مواد اولیه پس از 20 دقیقه روغن سویا اضافه شده و مجدداً همراه با اضافه کردن آب به میزان لازم به مدت 20 دقیقه با مخلوط کن برقی مخلوط شدند. به منظور ساخت پلت (دانه بندی خوراک 3-5/2 میلی متر)، جیره به چرخ گوشت منتقل شد. پس از پلت سازی، پلت ها بر روی سینی های خشک کن قرار داده شده و به خشک کن انتقال داده شدند. جیره ها پس از آماده شدن در ظروف پلاستیکی در دمای 4 درجه سانتی گراد و دور از نور قرار داده شده و برای غذادهی به ماهیان استفاده شد. غذادهی بچه ماهیان به میزان 5-3 درصد وزن بدن و در 5 وعده در ساعات 8، 11، 13، 15 و 18 انجام گردید. مدفوع و دیگر مواد باقیمانده هر روز از مخازن سیفون می شدند.
جدول2-1 : تجزیه تقریبی جیره پایه مورد استفاده برای تغذیه بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان
نوع ترکیبات میزان (% )
پروتئین 25/48
چربی 86/18
رطوبت 41/12
خاکستر 25/12
کربوهیدرات 23/8
انرژی انرژی ناخالص (کیلو ژول بر کیلوگرم) 2025

جدول 2-2 : ترکیب جیره ساخته شده برای تیمارهای مختلف
اجزای تشکیل دهنده (% ) جیره پایه 0.5% 1% 1.5% 2%
پودر ماهیa 43 43 43 43 43
آرد گندم 65/18 65/18 65/18 65/18 65/18
سویا 26 26 26 26 26
روغن سویا e 6 6 6 6 6
مکمل معدنیd 5/1 5/1 5/1 5/1 5/1
مکمل ویتامینیc 5/1 5/1 5/1 5/1 5/1
ویتامین C e 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0
ضد قارچe 25/0 25/0 25/0 25/0 25/0
دی کلسیم فسفاتf 1 1 1 1 1
سلولزb 2 95/1 90/1 85/1 80/1
مکمل نوکلئوتیدg 0 05/0 10/0 15/0 20/0
جمع 100 100 100 100 100
a Pars Kilka Corporation., Iran
b Merck Corporation., Germany
c Unit kg-1 of diet: Vitamin A, 1200000 IU; D3, 400000; E, 30 IU; K3, 1200mg; C 5400mg; H2, 200mg; B1,200mg; B2, 3600mg; B3, 7200mg; B5, 9000mg; B6, 2400mg; B9, 600mg; B12,4mg; antioxidant 500mg Career up to 1 kg.
d Unit kg-1 of diet: Fe, 4500 mg; Cu, 500 mg; Co, 50 mg; Se, 50 mg; Zn, 6000 mg; Mn, 5000 mg; I, 150 mg; choline chloride, 150000 mg; Career up to 1 kg.
e Khorak-Dam Abzian Corporation, Iran.
f Garmab Shimi Corporation, Iran. Contains: phosphor 17%, calcium 23.27%, moist 3%, fluorine 0.17%
g Chemoforma, Augst, Switzerland
2-5-سنجش فاکتورهای رشد:
برای بررسی رشد ماهیان و مقایسه بین تیمارها در هفته چهارم و هفته هشتم از شاخص های رشد شامل افزایش وزن بدن، شاخص وضعیت(CF)، ضریب تبدیل غذایی(FCR)، ضریب رشد ویژه(SGR) و درصد افزایش وزن بدن استفاده شد که با استفاده از فرمولهای زیر محاسبه گردید (Ricker, 2006):
فرمول 2-1- افزایش وزن بدن:
W1– W2 = (WG) افزایش وزن بدن
فرمول 2-2- ضریب تبدیل غذایی:
افزایش وزن بدن (گرم) / مقدار غذای خورده شده (گرم) = FCR
فرمول2-3-درصد افزایش وزن بدن:
100× W1/W1– W2 = (%WG) درصد افزایش وزن بدن
فرمول 2-4- ضریب رشد ویژه:
100 ×‌ دوره پرورش به روز / (Ln W2 – Ln W1) = SGR
فرمول 2-5- فاکتور وضعیت:
100 ×3 طول / وزن تر= CF
W2= وزن ثانویه (گرم) W1= وزن اولیه (گرم)
2-6-اندازه گیری فاکتورهای خونی:
در هفته چهارم و انتهای آزمایش (هفته هشتم) به صورت تصادفی از 5 عدد ماهی در هر واحد آزمایشی (15 عدد در هر تیمار) خون گیری به عمل آمد،یک روز قبل از خون گیری غذادهی قطع گردید. پارامترهای هماتولوژی شامل تعداد گلبول سفید و قرمز، هماتوکریت و هموگلوبین، میانگین حجم یک گلبول قرمز، میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز، میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز و درصد افتراقی گلبول های سفید در آنها مورد سنجش قرار گرفت. برای این کار ابتدا ماهیان بوسیله پودر گل میخک به مقدار 30 میلی گرم بر لیتر (Velisek et al., 2005) بیهوش گردیده و برای جلوگیری از ورود آب و موکوس به نمونه خون، ماهی کاملاً خشک شد. خون گیری از شریان دمی با قطع ساقه دمی صورت گرفت. نمونه خون بلافاصله به داخل تیوب های (اپندورف) ضدعفونی شده حاوی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) به عنوان ماده ضد انعقاد ریخته و فوراً به آزمایشگاه منتقل شد.
2-6-1- تهیه گسترش خونی و شمارش افتراقی گلبولهای سفید
برای این منظور بعد از خونگیری ابتدا یک قطره خون منعقد نشده را روی انتهای یک لام تمیز ریخته، سپس با لام سنگی با زاویه 30 تا 40 درجه، گسترش از خون تهیه گردید. پس از خشک شدن لام، جهت فیکس کردن از متانول خالص استفاده شد. سپس لام با رنگ گیمسا رنگ آمیزی شد. در پایان بعد از 20 دقیقه لام ها با آب مقطر شستشو داده شدند. برای تعیین درصد افتراقی گلبول های سفید ابتدا یک قطره روغن ایمرسیون روی لام رنگ آمیزی شده ریخته و سپس با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی100، لام ها مورد بررسی قرار گرفتند. برای تشخیص افتراقی، قسمتی از لام را که نازک و شامل یک لایه سلول است انتخاب کرده و شمارش گلبول های سفید بر حسب شکل آنها انجام شد. تعداد گلبولهای سفید شمارش شده در هر مرحله 100 عدد بود. سپس تعداد سلولهای بدست آمده بر حسب درصد بیان شد (Houston, 1990).
2-6-2-تعیین میزان هماتوکریت (HCT%)
برای تعیین میزان هماتوکریت از روشRehulka (2000) استفاده گردید. ابتدا بیش از دو سوم لوله هماتوکریت از خون منعقد نشده پر شد. جهت تعیین مقدار هماتوکریت از روش میکروهماتوکریت استفاده گردید، به طوری که لوله های هماتوکریت را درون دستگاه سانتریفوژ میکروهماتوکریت قرار داده و پس از سپری شدن 3 دقیقه با دور (rpm)13000 مقدار هماتوکریت به وسیله صفحه مدرج مخصوص قرائت شد.
2-6-3- تعیین مقدار هموگلوبین (Hb)
برای تعیین مقدار هموگلوبین از روشDaisley و Blaxhall (1983) استفاده گردید. مقدار 20 میکرو لیتر خون منعقد نشده با 50 میلی لیتر محلول درابکین مخلوط شده و 10-5 دقیقه در محیط تاریک قرارداده شد (روش Cyanmethemoglobin). سپس بوسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 540 نانومتر مقدار جذب را قرائت کرده و در نهایت مقدار هموگلوبین نمونه مورد نظر به وسیله منحنی استانداردی که قبلاً تهیه شده بود و بر اساس رابطه 2-6 محاسبه گردید.
رابطه 2-6- محاسبه میزان هموگلوبین:
غلظت استاندارد × ( ODاستانداد / OD نمونه) = (g/dl) Hb
2-6-4-شمارش گلبول قرمز(RBC)
برای شمارش تعداد گلبول قرمز از پیپت های حباب دار(ملانژور) قرمز استفاده گردید. تعداد گلبول قرمز با استفاده از لام نئوبار بعد از رقیق سازی خون منعقد نشده با محلول ریس (رقت 200/1) شمارش شد. از مربع میانی (5 خانه وسط) لام نئوبار برای شمارش گلبول قرمز استفاده و عدد بدست آمده در عدد10000 ضرب شد. تعداد گلبول های قرمز در یک میلی متر مکعب خون محاسبه گردید (Dorafshan et al., 2007).
2-6-5-شمارش گلبول سفید (WBC)
برای شمارش تعداد گلبول سفید از پیپت های حبابدار(ملانژور) سفید استفاده گردید. تعداد گلبول های سفید با استفاده از لام نئوبار بعد از رقیق سازی خون منعقد نشده با محلول ریس (رقت 50/1) شمارش شد. از4 مربع کناری لام نئوبار برای شمارش گلبول سفید استفاده و عدد بدست آمده در عدد50 ضرب شد. تعداد گلبول های سفید در یک میلی متر مکعب خون محاسبه گردید (Dorafshan et al., 2007).

2-6-6-تعیین سایر اندیس های خونی
برای محاسبه اندیس های خونی شامل میانگین حجم یک گلبول قرمز(MCV)، میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز(MCH) و میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز(MCHC)، از روابط زیر استفاده گردید (Dorafshan et al., 2007).
رابطه 2-7-میانگین حجم یک گلبول قرمز:
MCV (fl) = (مقدار هماتوکریت) / (mm3تعداد گلبول قرمز برحسب میلیون در ) ×10
رابطه 2-8-میانگین هموگلوبین یک گلبول قرمز:
MCH (pg) = (مقدار هموگلوبین) / (mm3تعداد گلبول قرمز برحسب میلیون در ) × 10
رابطه 2-9- میانگین درصد غلظت هموگلوبین در یک گلبول قرمز
MCHC (g /dL) = (مقدار هموگلوبین) / (مقدار هماتوکریت) × 100
2-7- اندازه گیری فاکتورهای بیوشیمیایی خون:
در انتهای آزمایش (هفته هشتم) به صورت تصادفی از 5 عدد ماهی در هر واحد آزمایشی خون گیری به عمل آمد (یک روز قبل از خونگیری غذادهی قطع گردید)، تا پارامترهای بیوشیمیایی خون شامل میزان پروتئین کل، آلبومین، گلوبولین، نسبت آلبومین به گلوبولین، تری گلیسرید، کلسترول و آنزیم های کبدی شامل آلکالین فسفاتاز (ALP)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST)، لاکتات دهیدروژناز (LDH) و آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) در آنها مورد سنجش قرار گیرد. برای این کار ابتدا ماهیان با استفاده از پودر میخک با غلظت 30 میلی گرم بر لیتر(Velisek et al., 2005) بیهوش گردیده و برای جلوگیری از ورود آب و موکوس به نمونه خون، بدن ماهی با استفاده از گاز استریل خشک گردید. خون گیری از شریان دمی با قطع ساقه دمی صورت گرفت. برای این کار از تیوب های اپندروف فاقد محلول ضد انعقاد خون استفاده شد و سپس سرم خون با استفاده از سانتریفیوژ (3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه)، جدا گردید.
2-7-1- اندازه گیری پروتیئن کل سرم
مقدار پروتئین کل سرم با استفاده از کیت تشخیصی شرکت ZiestChem با روش بیوره اندازه گیری شد. بطور خلاصه تست بیورت شامل واکنش بین یون های مس با باند های پپتیدی در یک محلول قلیایی است که در نهایت کمپلکس آبی مایل به بنفش با پایداری 60 دقیقه ایجاد می شود. شدت رنگ حاصل متناسب با مقدار پروتئین در نمونه است که در طول موج 560-520 نانومتر اندازه گیری شد (Kumar et al., 2005).
2-7-2- اندازه گیری آلبومین سرم
مقدار آلبومین سرم با استفاده از کیت تشخیصی شرکت ZiestChem با روش برموکرزول گرین اندازه گیری شد. بطور خلاصه این روش شامل واکنش آلبومین با برموکرزول گرین در شرایط اسیدی و تشکیل کمپلکس سبز مایل به آبی است که شدت رنگ آن متناسب با غلظت آلبومین موجود در نمونه است که در طول موج630 نانومتر اندازه گیری شد (Kumar et al., 2005).
2-7-3- محاسبه گلوبولین سرم
میزان گلوبولین با کم کردن آلبومین از پروتئین کل محاسبه شد (Kumar et al., 2005). مقدار پروتئین کل، آلبومین و گلوبولین بر حسب گرم بر دسی لیتر مورد سنجش قرار گرفت.
رابطه 2-10- میزان گلوبین در سرم:
آلبومین - پروتئین = (g/dl) گلوبولین
2-7-4-تعیین مقادیر کلسترول کل و تری گلیسرید
برای اندازه گیری مقدار کلسترول کل و تری گلیسرید سرم از روش آنزیمی، کالریمتری استفاده شد.